之前博主做免疫组化分析一直用的是Image-Pro Plus 6.0（下文简称IPP），这个软件分析免疫组化图片的阳性染色平均光密度值非常专业，但有时候分析整张照片的胞浆阳性染色平均光密度值则有可能会出bug扫不出组织总面积。而且与ImageJ比起来，IPP操作确实蛮复杂的。ImageJ本身是NIH的软件，优点在于免费、开源，而且各个平台，包括windows、MacOS、Linux都可用，👉下载链接👈。

ImageJ处理免疫组化图片要额外安装插件，目前常用的两个插件有IHC Toolbox和IHC profiler。博主看了一下IHC profiler相关内容，这个插件主要是对阳性区域进行评分并最终进行定性分析（阳性还是阴性，事实上博主并未亲自实践过），而IHC Toolbox可以出类似IPP的平均光密度值的数据。IHC toolbox插件👉下载地址👈。

1. 下载并打开插件

打开ImageJ，将插件下载好的.jar格式插件直接拖进ImageJ窗口，之后在Plugins菜单就会有IHC Toolbox的选项：

IHC Toolbox窗口大概长这样子：

2. 导入图片并转成灰度

把要分析的图片拖进ImageJ窗口，然后在IHC Tool Box窗口的Select Model选择“H-DAB”，并点击左下角的Color，此时会得到一张没有细胞核的图片。

在主界面点击“Image”，弹出的下拉菜单中选择“Type”，在子菜单勾选“8-bit”，此时没有细胞核的那张图片就会变成灰白图片。

此时会发现，大概阳性染色区域的灰度值更深一些，非阳性染色区域的灰度值更浅甚至直接是白色的。接下来的操作是基于这张图片的灰度值尽可能选择上阳性区域，并计算相应区域的平均光密度值。

3. 校正

在主界面点击“Analyze”→“Calibrate”，在弹出窗口的Function菜单中直接选择最后一项“Uncalibrated OD”，然后点“OK”，此时会出现一条含倒抛物线的窗口。别管它，直接最小化。

4. 计算阳染区域

在主界面菜单中依次点击“Image”→“Adjust”→“Threshold”（快捷键：Ctrl+Shift+T），然后拖动上下两个条条，直到灰色图片上的红色区域基本覆盖原图片的阳性区域为止。

5. 测量阳染区平均光密度值

点击主界面菜单“Analyze”→“Measure”（快捷键：Ctrl+M）。博主倾向于使用后面的“&Area”值作为平均光密度值。

如果需要分析局部区域的阳性染色平均光密度值，可以用主界面的圈圈（此处非叠字卖萌，第一个圈是动词，第二个圈是名词😿）或者框框（第一个框是动词，第二个框是名词😿）工具

总结

总得来说，ImageJ分析免疫组化阳染区域与IPP相比还是很简单的，而且ImageJ是NIH的工具，可能认可度会更高一些。